la microperfusion in vitro I

La microperfusion in vitro est l'étude de segments de néphrons isolés par microdissection.

1. Obtention des échantillons

1.1. Animaux

Les études ont été réalisées sur des souris mâles (C57/BL6 J) de 20 à 35g et des rats mâles de 80 à 120g (Sprague Dawley) élevés à l’abri de tous pathogènes.

1.2. Régimes et traitement

Les animaux sont entretenus avec une nourriture normale pour rat et souris (A04, SAFE, France) contenant 0,3% de Na+ et 0,6%.de K+, suivant les recommandations d'études diététiques. 

Pour étudier la réponse rénale à une perte en sodium ou en potassium, les animaux peuvent être alimentés avec des régimes spéciaux.

La nourriture carencée en Na+ contient 0,01 % de Na+ et 0.6 % de K+. La nourriture carencée en K+, contient moins de 0,01% de K+ et 0.3 % de Na+ (SAFE, France).

1.3. Dissection

L'animal est anesthésié avec du pentobarbital de sodium (50 mg/kg, IP) et les reins sont prélevés et rapidement plongés dans 5 ml de bain (voir composition plus loin) conservé à 4°C. De fines tranches sont découpées à partir du centre du rein dans l'axe cortico-papillaire à l'aide d’une lame de rasoir. Les tranches sont conservées dans de la solution de bain à 4°C.

Pour la dissection, des pinces fines (Dumond #5) sont aiguisées sous loupe à l’aide de trois papiers abrasifs de grains de plus en plus fins (30, 12 et 3 μm) (Thomas Technological Service). Les tubules sont isolés sous loupe à 17 °C dans la solution de bain complémentée avec 6% d’albumine de sérum de boeuf (BSA) pour éviter que les échantillons ne collent aux pinces. Pour isoler des CCD et les CTAL, il faut tout d’abord séparer les raies médullaires (faisceaux de CCD, CTAL et pars recta) du labyrinthe cortical à l’aide de grosses pinces peu aiguisées. Les CCD ou les CTAL sont ensuite séparés des pars recta à l’aide des pinces fines en tirant uniquement sur les extrémités des tubules. Une fois le tubule d’intérêt isolé, ses extrémités sont nettoyées à l’aide d’une minutie aiguisée en forme de couteau. Puis, le tubule est transféré dans la chambre de microperfusion à l’aide d’une seringue Hamilton de 25 μl munie d’un cathéter en polyéthylène courbé.

2. La cage de Faraday et le microscope

FIGURE 1

La DPte d’un segment de néphron n'est que de quelques mV et n'est détectable qu'à l'écart des champs électriques des appareils et des champs électrostatiques produits par le mouvement des expérimentateurs. C'est pourquoi le dispositif de microperfusion (microscope et micromanipulateurs) est entouré d'une cage de Faraday. De plus, tous les appareils situés à l'intérieur de la cage sont alimentés par pile.

Le microscope inversé (Axio vert 35 M, Zeiss) et les micromanipulateurs sont fixés sur une table en marbre qui limite la transmission des vibrations extérieures (figure1).

FIGURE 2

La chambre de microperfusion est une cuve d’une contenance d’un mm3 creusée dans une rondelle de plexiglas. Le fond de la chambre est fermé par l’apposition d’une lamelle de verre collée avec de la cire de dentiste. Plusieurs perforations dans le haut de la chambre permettent l’arrivée et le retrait du bain, le passage d’un pont Agar-NaCl et le passage de la sonde thermique (figure 2).

3. Bain et perfusât
Le bain est une solution de composition ionique et d’osmolarité similaire au plasma (table 1) maintenue à 37 °C et à pH 7.4. Plusieurs bains de compositions différentes peuvent alimenter la chambre à tour de rôle grâce à un jeu des vannes multidirectionnelles. Le bain s’écoule dans la chambre par gravitation et son débit est ajusté manuellement (5 à 15 ml/min) grâce un clamp. Le bain passe dans une jaquette en verre où il est chauffé pour atteindre 37 ± 1°C dans la chambre. La température dans la chambre est constamment contrôlée. Le bain contenant du bicarbonate est tamponné à l’aide d’un bullage au carbogène (5% CO2/ 95% O2). A la sortie de la chambre, le bain est récupéré dans un bidon par un système d’aspiration relié à une pompe péristaltique ou à une pompe à membrane. Par économie, le bain peut être recyclé lorsqu’il contient des produits coûteux (figure 3).

Le perfusât peut être équivalentau bain en concentration et en osmolarité. Pour voir l’évolution de la perméabilité paracellulaire, un gradient ionique est créé pour un ou plusieurs ions entre la lumière tubulaire et le bain. Le perfusât peut aussi être changé en quelques minutes pour apporter à la face luminale les inhibiteurs ou activateurs désirés.

Les concentrations sont indiquées en mM. Les bains peuvent être tamponnés par deux systèmes : NaHCO3/CO2 et Hepes/Tris. Le pH se stabilise à 7,4°C après 2 heures de bullage s’il n’y a pas de tampon Hepes/Tris. Cette solution peut être préparée et gardée pendant 5 jours à 4°C ou pendant 1 mois à -20°C. Tous les produits proviennent de Sigma-Aldrich, France.