Traitement des échantillons

6. Traitement des échantillons

Tous les produits décrits dans ce paragraphe proviennent de Sigma-Aldrich, France.

6.1. Collections et traitement des échantillons

Une fois le tubule perfusé, le fluide remontant dans la pipette de collection peut être prélevé (figure 35). Quatre à cinq échantillons de 20 à 30 nl sont prélevés et le temps nécessaire à chaque collection est mesuré. A la fin de l'expérience, la longueur du tubule exposé au bain est mesurée grâce à un micromètre oculaire.

Les échantillons sont déposés sur la plaque d'argent sous huile (saturée en eau) à proximité de gouttes de 2 μl de bain, de solution de perfusion, d’une solution étalon et d’une dilution ½ de cette solution (Na 170 mM, K 6 mM, créatinine 17 mM). Le volume des échantillons est mesuré à l’aide d'une pipette calibrée de 20 à 30 nl puis ils sont transférés dans une fiole de 500 μl pour Dionex, remplie de 39 μl d’une solution de carbonate de lithium (LiCarb) : 10 ml d’eau pure, 180 μl d’acide méthanosulfonique (HMSA, 1M), 50 μl de LiCarb (4 mM). Avec la même pipette calibrée, trois échantillons de bain, trois prélèvements de chacun des deux étalons et 6 échantillons de perfusion sont également transférés dans des fioles pour Dionex.

Les fioles sont conservées à -20°C et les échantillons sont analysés en général le lendemain, mais ils peuvent être conservés plusieurs mois à -20°C.

6.2. Mesure de la quantité de Na+, K+ et créatinine

Les échantillons sont analysés par chromatographie ionique à haute pression (HPLC) sur un système modulable Dionex Ultimate 3000 (Thermofisher, France). Les cations des échantillons sont séparés sur colonne anionique CS12A puis élués par l’HMSA 18mM avant de passer dans une cellule de conductimétrie et devant un lecteur UV. La sensibilité de la lecture est augmentée par le passage des cations dans un ensemble de membranes "suppresseur" où l'HMSA est remplacé par des ions OH- provenant de l’ionisation de l’eau. Ainsi le bruit de fond formé par l'HMSA est annulé et les ions OH- associés aux cations augmentent la conductance ionique. La créatinine, qui est utilisée comme marqueur volumique afin de calculer le débit de perfusion à partir du débit de collection qui est mesuré, n'étant pas chargée, sa concentration est déterminée par absorbance dans les UV (235 nm).

6.3. Titration du chlore

Après avoir distribué les échantillons dans les fioles pour Dionex, les reliquats sont utilisés pour faire 5 à 6 gouttes de 0.2 nl à l’aide d’une pipette à constriction. Le chlore est ensuite titré dans chaque goutte par une méthode adaptée de la technique mise au point en 1955 par J. A. Ramsay, R. H. Brown et P. C. Crocghan (figure 7). Les valeurs de chaque goutte sont moyennées pour obtenir la concentration de chlore de l’échantillon.

FIGURE 7

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(A) Des gouttes de 0,2 nl de solution d’étalons, de bain, de perfusât et de collections sont déposées sur une plaque d’argent et sous huile de paraffine à l’aide d’une pipette calibrée. La plaque d’argent est mise à la terre d’un électromètre. Une pipette de verre dont la pointe fait 10 μm de diamètre, contenant un gel de NaNO3 (0,1 N) et d’agar (2%), est plongée dans l’échantillon. La pipette est reliée à une solution d’AgNO3 (1M) par un cathéter dans laquelle est immergé un fil d’argent relié à l’entrée de l’électromètre. Lorsque le circuit est fermé, l’électromètre affiche une différence de potentielle (Dp) d’environ + 480 mV (somme de tous les potentiels de jonctions du circuit, majoritairement due à la jonction Ag+/AgCl/Cl-). Un courant est alors appliqué dans le circuit et les ions Ag+ libérés précipitent le Cl- pour former de l’AgCl. Le courant passe en même temps dans un condensateur (20 μF) placé en série dans le circuit. La charge injectée s’affiche sur l’électromètre. La différence de potentiel diminue au fur et à mesure que du courant est injecté. Puis, à + 240 mV, le potentiel chute brutalement. C’est le point de la courbe de titration choisi arbitrairement pour définir la valeur de courant qui sera utilisée pour calculer la concentration en chlore contenue dans les échantillons (B). Les échantillons d’étalons sont titrés en premier et les charges enregistrées pour chaque goutte sont utilisées pour tracer une courbe de calibration (C). Ensuite, la charge des gouttes de chaque échantillon de bain, perfusât et collection sert à calculer la concentration de chlore qu’elles contiennent. L’erreur standard des concentrations obtenues pour l’ensemble des échantillons bain et perfusât n’excède pas 2 %












7. Calculs des flux

Les concentrations de Na+, K+, Cl- et Créatinine sont calculées à partir des aires sous les pics grâce aux courbes de calibration faites en utilisant les étalons. Les flux nets des ions sont ensuite calculés en utilisant le temps de collection et la longueur du tubule par les équations suivantes :

JCl = ([Cl]p x Vp – [Cl]c x Vc)/ L
 JK = ([K]p x Vp – [K]c x Vc)/ L

                                      JNa = ([Na]p x Vp – [Na]c x Vc)/ L

                                              

 Le débit de perfusion est calculé par :

                                                  Vp = [Cr]c /[Cr]p x Vc

Où [Cr]c et [Cr]p sont les concentrations de créatinine dans les fluides collecté et perfusé.

Le flux d’eau est calculé par :

                                                  Jeau = (Vp – Vc) / L

Où Vp et Vc sont les débits de perfusion et de collection, [X]p et [X]c les concentrations de l’ion X dans les fluides perfusé et collecté,  et L la longueur du tubule.

Les valeurs obtenues (en pmoles.min -1.mm-1 pour les flux ioniques et en nl.min-1.mm-1 pour les flux d'eau) sont positives  lorsqu'il s'agit d'une absorption et négatives lorsqu'il s'agit d'une sécrétion. Pour chaque tubule, les flux sont déterminés pour chacune des 4-5 collections et leur valeur moyenne est calculée.  Pour chaque condition expérimentale, au minimum quatre expériences (animaux) sont réalisées.  Les résultats présentés sont des moyennes ± SEM de tubules (animaux) différents.  Le test t de Student est utilisé pour comparer deux situations.